V. Jakab skót király és Lotaringiai Mária hercegnő (Marie de Guise) leányaként született. Egyhetes sem volt, amikor apja 1542. december 14-én az angolokkal folytatott Solway Moss-i csatában elesett, s Mária a trónra került. Az angolok, akik már régen fennhatóságuk alá akarták vonni Skóciát, VIII. Henrik fiát, VI. Eduárdot akarták Stuart Mária férjévé tenni. Skóciának azonban nem volt hasznára az angol terv, ezért a skótok franciabarát politikába kezdtek. Mária hatéves korában a francia király, II. Henrik udvarába került, ahol reneszánsz nevelésben részesült. Tizenhat éves korában, 1558-ban a később II. Ferenc néven király, az ugyancsak tizenhat esztendős trónörökös felesége lett, ezzel a Skócia és Franciaország közötti dinasztikus kapcsolat megköttetett. Férje egy év elteltével, 1559-ben a trónra lépett, de másfél évvel később bekövetkező korai halála után, 1561-ben Mária visszatért Skóciába.

Hazájában nem fogadta béke, katolikus vallása miatt rendszeres támadásokat kellett elviselnie a skóciai protestánsok részéről, s a skót főurak egy bizonyos köre késznek mutatkozott a Mária-ellenes összeesküvésre. Ugyanakkor az állami kincstár is szűkösnek bizonyult a kormányzati célok végrehajtására. A nehézségeket tetézte, hogy Mária 1565-ben házasságra lépett egyik közeli rokonával, Darnley urával, azaz Stuart Henrikkel. A frigy azonban nem bizonyult tartósnak, Darnley ugyanis társuralkodó szeretett volna lenni, s céljai elérése érdekében 1566-ban megölette hitvese, a királynő titkárát, David Rizziót. 1567-ben, a február 10-ére virradó éjszaka Bothwell és Morton earljei meggyilkolták Darnleyt. A királynő nem vonta felelősségre a bűnösöket, ami népe szemében bűnössége beismerésével is felért. Áprilisban a hatalomra törekvő Bothwell elraboltatta Máriát és kényszerítette, hogy feleségül menjen hozzá. (Később, 1570-ben Mária kérésére a pápa érvénytelenítette ezt a házasságot.)

Eddigre a skótok elégedetlensége forrpontra jutott. Polgárháború tört ki és 1567 júniusában Mária a felkelők kezére jutott, akik kényszerítették, hogy trónjáról lemondjon fia, a kiskorú Jakab javára. A következő évben, 1568-ban Angliába menekült és unokatestvérétől, I. Erzsébettől kért segítséget, egyúttal menedéket. Erzsébet azonban nemcsak hogy megtagadta a segítségét, de érdekből szigorú őrizet alatt tartotta Máriát a vidéki Fotheringay-kastélyban. Nem támogathatta Mária terveit, mert ezzel Skócia haragját váltotta volna ki; Franciaországba sem engedhette, mert akkor az esetleges francia segítség az angol trónt is fenyegette volna; ugyanakkor szabadságát is el kellett vennie, nehogy Erzsébet katolikus ellenzékének vezéralakja legyen.

Mária igyekezett az egyre szigorodó fogságból kiszabadulni, s ennek érdekében két évtized alatt a legkülönfélébb – sikertelen – udvari összeesküvésekben vett részt. Az egyik titkos levele, amelyben elfogadta az Erzsébet meggyilkolásával végződő tervet, Erzsébet tudomására jutottak – többi, titkos leveleivel együtt –, s ennek következményeként Máriát elítélték és 1587. február 8-án fogsága színhelyén, a kastély egyik termében, háromszáz meghívott vendég jelenlétében lefejezték. Kivégzésének híre nagy felháborodást keltett, s a nagy-britanniai katolikusok vértanújukként kezdték tisztelni Máriát.